② 体外实验:分别构建RBP1过表达/敲减SCC15细胞系,利用集落形成实验、MTT及细胞周期实验分析过表达/敲减RBP1后细胞生长变化,利用划痕实验、Transwell实验分析细胞迁移和侵袭变化(上一步的临床分析显示RBP1高表达与肿瘤进展相关,因此利用细胞表型实验分析RBP1在肿瘤中的具体作用)。
③ 体内实验:皮下注射构建RBP1敲减小鼠模型,分析小鼠移植瘤变化,随后利用qRT-PCR、IHC、WB检测肿瘤块中RBP1的表达量(一般体内实验会紧跟着体外实验,为节约成本,体内的基因敲减/过表达经常会只做其中一种)。
② 自噬流分析:LC3-II的积累表明上游自噬体形成增加或下游自噬-溶酶体融合受损。为确定具体是哪一种调控过程,利用自噬抑制剂BAF进行处理以阻止下游自噬-溶酶体融合,分析RBP1过表达细胞中的GFP-LC3的结合点数变化(通常意义上所讲的自噬包括几个过程:自噬体形成、自噬底物向溶酶体运送、自噬体与溶酶体融合、自噬体内容物被溶酶体降解等,这个动态的过程称为自噬流。LC3参与自噬体的形成,自噬体形成时,胞浆型LC3(即LC3-I)会酶解掉一小段多肽,转变为自噬体膜型(即LC3-II),LC3II升高代表自噬的启动,绿色荧光蛋白(GFP)基因常用做报告基因)。
③ 自噬与RBP1致癌分析:为确定RBP1调节的自噬是否参与了OSCC细胞的生长、迁移和侵袭,敲减自噬相关基因ATG5进行功能回复实验,分析RBP1过表达细胞表型的变化(功能回复实验可以用来确定自噬是否参与RBP1调节的细胞表型变化)。
② CKAP4与细胞自噬:为探讨CKAP4在自噬中可能行使的调控作用,敲减/过表达CKAP4,qRT-PCR检测自噬相关基因Beclin 1,ATG5和LC3-II/LC3-I的表达变化及自噬泡数量的变化(互作蛋白通常会行使相似的生物学功能)
③ RBP1、CKAP4与自噬:为探讨RBP1是否联合CKAP4诱导自噬,影响细胞生长、迁移和侵袭。敲减CKAP4,观察细胞表型变化,随后过表达RBP1进行功能回复,观察表型变化。敲减CKAP4和ATG5,观察RBP1过表达细胞表型变化(功能回复实验确定RBP1通过CKAP4轴诱导的自噬增强OSCC细胞的生长、迁移和侵袭)。