国自然中自噬研究是这样展开的

2020年国自然基金申请的科学部初审已经结束，下一步的通讯评审和专家评审组评审正在紧锣密鼓地进行着。由于科学基金实行竞争机制、择优支持，在有限的经费条件下，资助项目只能优中选优，因此想要通过所有评审，顺利拿到国自然基金，那么标书内容一定要有深度和广度，既要有科研价值，又要有创新性，还需确保研究可行性。

错过今年基金申请的老师不要再懊悔了，赶紧行动起来吧，预实验可以做起来了，标书撰写也要练起来了，争取明年顺利通过所有的评审，成功晋级。今天小编给大家分享一篇今年6月份发表在Cell Death & Disease（IF=6.30）上研究自噬的国自然资助的文章“The RBP1–CKAP4 axis activates oncogenic autophagy andpromotes cancer progression in oral squamous cell carcinoma”，文章研究思路简单清晰，非常适合用来模仿练习国自然标书的撰写。

1. 立项依据

口腔鳞状细胞癌（OSCC）是口腔最常见的恶性肿瘤之一，约占口腔癌的90%。尽管治疗手段提高了，但OSCC的死亡率和复发率仍较高，5年生存率低于50%，目前对OSCC的生物学和病理学研究较为匮乏。

维甲酸能抑制肿瘤的发生，调控癌细胞的生长、分化和凋亡。视黄醇结合蛋白1 (RBP1)负责调节组织中维甲酸的稳态，有报道称RBP1在包括OSCC在内的几种人类癌症中异常表达，然而，RBP1在OSCC发病中的作用和分子机制尚不清楚。

自噬作为一个动态降解和循环系统，为应激反应提供生物材料和能量。自噬在癌症的发病机制中具有复杂的作用，通过驱动癌基因和抑癌基因刺激或抑制肿瘤发生。探讨RBP1和自噬在OSCC进展中的潜在作用，有助于为OSCC治疗提供新的途径。（立项依据也就是研究背景，一般基于已有的文献报道以及前期预实验的结果）

2. 技术路线

3. 研究内容

1）OSCC中差异表达蛋白RBP1的分析

①　表达量分析：利用iTRAQ联合2D LC-MS/MS分析OSCC组织中潜在的肿瘤标志物，发现显著高表达的RBP1。利用qRT-PCR对OSCC中RBP1的表达进行扩大样本量分析，并利用IHC进一步验证。临床分析确定RBP1表达与OSCC分化差、肿瘤晚期及淋巴转移密切相关（这一部分研究一般会在预实验时完成，也就是说写标书的时候已经获得了这一部分的结果，它们是立项依据的一部分）。利用qRT-PCR分析各细胞系中RBP1的表达量。

②　体外实验：分别构建RBP1过表达/敲减SCC15细胞系，利用集落形成实验、MTT及细胞周期实验分析过表达/敲减RBP1后细胞生长变化，利用划痕实验、Transwell实验分析细胞迁移和侵袭变化（上一步的临床分析显示RBP1高表达与肿瘤进展相关，因此利用细胞表型实验分析RBP1在肿瘤中的具体作用）。

③　体内实验：皮下注射构建RBP1敲减小鼠模型，分析小鼠移植瘤变化，随后利用qRT-PCR、IHC、WB检测肿瘤块中RBP1的表达量（一般体内实验会紧跟着体外实验，为节约成本，体内的基因敲减/过表达经常会只做其中一种）。

2）RBP1与细胞自噬分析

①　自噬蛋白表达分析：为研究RBP1是否参与细胞自噬，敲减/过表达RBP1，分析自噬相关蛋白Beclin1、ATG5和 LC3-II/LC3-I表达变化，并利用电子显微镜分析自噬泡数量的变化（这一部分研究一般也会在预实验里完成，作为立项依据）。

②　自噬流分析：LC3-II的积累表明上游自噬体形成增加或下游自噬-溶酶体融合受损。为确定具体是哪一种调控过程，利用自噬抑制剂BAF进行处理以阻止下游自噬-溶酶体融合，分析RBP1过表达细胞中的GFP-LC3的结合点数变化（通常意义上所讲的自噬包括几个过程：自噬体形成、自噬底物向溶酶体运送、自噬体与溶酶体融合、自噬体内容物被溶酶体降解等，这个动态的过程称为自噬流。LC3参与自噬体的形成，自噬体形成时，胞浆型LC3(即LC3-I)会酶解掉一小段多肽，转变为自噬体膜型(即LC3-II)，LC3II升高代表自噬的启动，绿色荧光蛋白(GFP)基因常用做报告基因）。 

③　自噬与RBP1致癌分析：为确定RBP1调节的自噬是否参与了OSCC细胞的生长、迁移和侵袭，敲减自噬相关基因ATG5进行功能回复实验，分析RBP1过表达细胞表型的变化（功能回复实验可以用来确定自噬是否参与RBP1调节的细胞表型变化）。

3）RBP1与CKAP4互作分析

①　RBP1互作蛋白分析：利用Co-IP结合MS分析与RBP1互作的蛋白，确定CKAP4，生信分析进一步验证两者互作关系（这一部分一般会在预实验中完成，作为立项依据）。利用荧光免疫细胞化学确定RBP1与CKAP4亚细胞定位。利用qRT-PCR分析CKAP4在OSCC组织中表达量，皮尔森相关系数分析RBP1与CKAP4表达相关性（识别某一蛋白的互作蛋白和蛋白间的互作关系有助于理解潜在的分子机制）。

②　CKAP4与细胞自噬：为探讨CKAP4在自噬中可能行使的调控作用，敲减/过表达CKAP4，qRT-PCR检测自噬相关基因Beclin 1，ATG5和LC3-II/LC3-I的表达变化及自噬泡数量的变化（互作蛋白通常会行使相似的生物学功能）

③　RBP1、CKAP4与自噬：为探讨RBP1是否联合CKAP4诱导自噬，影响细胞生长、迁移和侵袭。敲减CKAP4，观察细胞表型变化，随后过表达RBP1进行功能回复，观察表型变化。敲减CKAP4和ATG5，观察RBP1过表达细胞表型变化（功能回复实验确定RBP1通过CKAP4轴诱导的自噬增强OSCC细胞的生长、迁移和侵袭）。

4. 研究目标

1) 分析差异蛋白RBP1与OSCC发生发展相关性；

2) 研究OSCC发生发展中细胞自噬与RBP1的相关性；

3) 探索RBP1通过CKAP4轴诱导的自噬参与OSCC发生发展的具体机制。

5. 特色与创新之处

1）特异性高表达RBP1通过调节细胞自噬促进OSCC发生发展。

2）RBP1通过互作蛋白CKAP4参与调节细胞自噬进而影响OSCC发生发展。

文章并不复杂，通过高通量筛选，选定差异表达最显著的蛋白进行后续分析，通过体内外敲减/过表达实验，分析RBP1与OSCC的相关性，然后将RBP1与细胞自噬进行关联分析，最后从蛋白互作的角度进一步揭示RBP1与OSCC细胞自噬的相关性。文章思路清晰，验证充分，是练习撰写国自然标书很好的范本。

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